Как провести учет кишечной палочки с помощью метода Кесслера?
А как провести учет микроорганизмов на готовой продукции?
new, Для оценки качества сырья, полуфабрикатов, вспомогательных материалов, готовой продукции в нашей стране в основном используются два показателя— общая бактериальная обсемененность (ОБО) и количество бактерий кишечной группы (преимущественно кишечной палочки).
Общая бактериальная обсемененность. Ее определяют в основном чашечным методом. Выполнение анализа включает четыре этапа: приготовление ряда разведении из отобранных проб (при обследовании поверхности продукта или оборудования пробу отбирают путем смыва или соскоба с определенной площади); посев на стандартную плотную питательную среду (для выявления бактерий — на мясопептонный агар в чашки Петри); выращивание посевов в течение 24—28 ч в термостате при 30 °С; подсчет выросших колоний. Число колоний, выросших на каждой чашке, пересчитывают на 1 г или 1 мл продукта с учетом разведения. Окончательным результатом будет среднее арифметическое от результатов подсчета колоний в 2—3 чашках.
Полученные результаты будут меньше истинного обсеменения продукта, так как чашечным методом учитываются только сапрофитные мезофильные бактерии
(аэробы и факультативные анаэробы). Термофильные и психрофильные бактерии не растут из-за несоответствия температуры оптимальной; анаэробы не растут, поскольку выращивание проводится в аэробных условиях; другие бактерии (в частности, патогенные) не растут из-за несоответствия питательной среды и условий культивирования. Не образуют колоний мертвые клетки. Однако эти микроорганизмы можно не учитывать и ошибкой анализа пренебречь, поскольку сапрофиты являются основными возбудителями порчи пищевых продуктов.
В некоторых производствах (консервном, сахарном, хлебопекарном и др.) используются дополнительные микробиологические показатели, например количество анаэробных, термофильных, спорообразующих и других микроорганизмов , характерных для каждого вида исследуемого объекта. Для их учета имеются специальные методические приемы, описанные в соответствующей нормативной документации. Например, для определения процентного содержания спорообразующих бактерий посев производят из пробирок с разведениями проб, предварительно прогретых несколько минут в кипящей водяной бане. При посевах из прогретых проб вырастают только спороносные бактерии, а из непрогретых—все остальные. Затем рассчитывают процентное содержание спорообразующих форм микроорганизмов .
Чем выше показатель общей бактериальной обсемененности, тем больше вероятность попадания в исследуемый объект патогенных микроорганизмов—возбудителей инфекционных болезней и пищевых отравлений.
Обычно в 1 г (или 1 мл) продукта, не прошедшего термической обработки, содержится не более 100 тысяч сапрофитных мезофильных бактерий. Если же их количество превышает 1 млн. клеток, то стойкость готового продукта при хранении снижается и его употребление может нанести вред здоровью человека.
Определение бактерий кишечной группы основано на способности кишечной палочки сбраживать лактозу до кислоты и газа. При санитарно-гигиеническом контроле сырья, полуфабрикатов, готовой продукции исследование на наличие бактерий кишечной группы ограничивают проведением так называемой первой бродильной пробы.
Бродильную пробу осуществляют путем посева в пробирки со специальной дифференциально-диагностической средой для кишечной палочки (среда Кесслера с лактозой) различных объемов (или навесок) исследуемого объекта—1,0; 0,1;
0,01; 0,001 мл (или г). Пробирки с посевами помещают в термостат при 37 °С на 24 ч, затем их просматривают и устанавливают бродильный титр, т. е. те пробирки, в которых наблюдается рост (помутнение среды) и образование газа в результате брожения. При отсутствии газообразования объект контроля считают не загрязненным кишечной палочкой. При наличии газообразования производят вычисление коли-титра для различных объектов контроля по специальным таблицам. Существуют нормы допустимой общей бактериальной обсемененности и содержания кишечной палочки в объектах контроля.
Pegas, Используют среду Кесслер, бульон лактоза — бриллиантовый зеленый — желчь. По 1 мл соответствующих разведений исследуемого продукта засевают параллельно в три пробирки с питательной средой и обратными пробирками. Посевы инкубируют при температуре 30±1°С в течение 48dz3 ч. Предварительно посевы просматривают через 24+3 ч и отмечают пробирки, в которых отмечено газообразование. Окончательный учет проводят через 48±3 ч.
Положительными считают пробирки, в которых через 48 ч наблюдается интенсивный рост микроорганизмов, проявляющийся в сильном помутнении среды, образовании любого количества газа и подкислении среды, при необходимости, если в пробирках отмечаются интенсивный рост микроорганизмов и подкисление среды, но нет видимого газообразования, в целях подтверждения проводят посев на любую плотную селективнодиагностическую лактозную среду.
Посевы на плотной питательной среде термостатируют при температуре 30+ГС в течение 24±3 ч. Затем посевы просматривают и, если нет колоний, характерных для бактерий группы кишечной палочки, чашки оставляют еще на 24±3. После инкубирования исследуют морфологию выросших колоний. На среде Эндо колиформные бактерии образуют блестящие овальной формы колонии красного или бледнорозового цвета, часто с металлическим блеском. В сомнительных случаях окрашивают мазки по Граму и микроскопируют.
Не менее 5+1 колоний, имеющих характерную морфологию, пересевают в жидкую лактозную среду. Посевы выдерживают при температуре 30+°С в течение 24+3 ч и отмечают газообразование и изменение цвета среды. Окончательный результат получают через 48+3 ч.
Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
А вот по стандарту СЭВ
Метод с использованием плотной среды. Приготовление разведений производится в соответствии со стандартным методом.
Для определения используют агар с кристаллическими фиолетовым, нейтральным красным, желчью и агар с бриллиантовым зслены.м, фенолротом и лактозой. При посеве на поверхность среды каждое из разведений высевают по 0,1—0,2 мл соответствующего разведения параллельно на две чашки Петри с предварительно хорошо высушенной лактозной агаризоваиной средой. Не позднее чем через 10 мин после нанесения ннокулята на среду его растирают отдельно на каждой чашке согнутой стеклянной палочкой. При посеве в агарнзованную среду по 1 мл исследуемого продукта или разведения засевают параллельно в две чашки Петри. Не позднее чем через 15 мин заливают 15 мл разогретой и охлажденной до 45±1 °С одной из вышеуказанных сред. Посевы хорошо перемешивают, покачивая чашку Петри, и оставляют для застывания в горизонтальном положении.
Для продуктов, обильно обсемененных посторонней микрофлорой или содержащих сублетально поврежденные микроорганизмы, преимущественно используют агар с бриллиантовым зеленым, фенолротом и лактозой.
Посевы инкубируют при температуре 30±0,5°С в течение 48±3 ч. Предварительно посевы просматривают через 24±3 ч и отмечают колонии, типичные для бактерий группы кишечной палочки. Окончательный подсчет количества типичных колоний проводят через 48±3 ч. I Результаты оценивают по каждой пробе отдельно. Для подсчета отбирают чашки с посевами из тех разведений, где выросло F от 15 до 150 типичных колоний бактерий группы кишечной палочки.
Щелочеобразующая сопутствующая микрофлора не оказывает I значительного влияния на морфологию колоний бактерий группы I кишечной палочки при посеве на агар с кристаллическим фиолето% вым, нейтральны.м красным и желчью.
Р При массивно.м росте щелочеобразующей сопутствующей микрофлоры агар с бриллиантовым зеленым, фенолротом и лактозой становится красным и желтая прозрачная зона вокруг колоний сужается или исчезает, однако это наступает, как правило, только после инкубирования в течение 48 ч. Колонии бактерий группы кишечной палочки отличаются от колоний сопутствующей микрофлоры по их желтой окраске и в большинстве случаев по желтому пятну под колонией.
Определение с использованием жидкой сред ы. Приготовление разведений производится в соответствии со стандартным методом.
А есть способы, позволяющие избавиться от кишечной палочки?
В микробиологической практике используется большое количество питательных сред для учета бактерий группы кишечной палочки.
Стандартный метод определения бактерий группы кишечной палочки. Готовят ряд десятикратных разведений исследуемого продукта. В качестве питательных сред используются среды Кесслер, Эндо, Козера, среда с глюкозой.
Определение бродильного титра. По 1 мл соответствующих разведений продукта (табл. 164) засевают в пробирки с 5 мл ареды Кесслер. Посев 10 мл пастеризованного молока, отобранного после пастеризатора, 10 мл закваски на чистых культурах или 10 мл разведения 1 : 10 qyxnx молочных смесей «Малютка» и «Малыш» и сгущенного молока с сахаром производится в колбочки с 40—50 мл среды Кесслер.
Пробирки или колбочки с посевами помещают в термостат при 37±1 °С на 18—24 ч. Просматривают пробирки с посевами и по наличию газообразования в них определяют количество бактерий группы кишечной палочки. При отсутствии газообразования через 18— 24 ч продукт считают не загрязненным бактериями группы кишечной палочки. Для сухих и сгущенных молочных консервов, сухих и жидких смесей «Малютка», «Крошечка» и «Малыш», творога, сметаны, масла и сыра анализы на этом заканчивают.
При исследовании мороженого пробирки с посевов выдерливают в термостате при 37±1 °С в течение 48 ч.
Если при контроле цельномолочных продуктов (пастеризованного молока и сливок, кисломолочных напитков) бактерии группы кишечной палочки обнаружены в объеме менее 0,3 мл (т. е. газообразование обнаружено в 5—6 пробирках), то допускается проведение дальнейшей идентификации.
Идентификация бактерий группы кишечной палочки. Из пробирок, в которых наблюдается брожение, проводят посев на среду Эндо с таким расчетом, чтобы получить отдельные колонии. Для этого берут петлей посевной материал и высевают культуру частым штрихом. Перед посевом дно чашки со средой Эндо делят на четыре сектора. Посев из каждой пробирки со средой Кесслер производят на отдельный сектор. Чашки с посевами помещают крышками вниз в термостат с температурой 37±1 °С на 18—24 ч. Если газообразование обнаружено в пробирках с большим разведением и отсутствует в пробирках с предыдущим разведением, то на среду Эндо высевают из всех пробирок с предыдущим разведением.
При отсутствии на среде Эндо колоний, типичных для бактерий группы кишечной палочки (красных, с металлическим блеском, розовых, бледнорозовых), продукт считают не загрязненным кишечной палочкой. При наличии на среде Эндо колоний, типичных для бактерий группы кишечной палочки, их изучают. Из изолированных колоний, характерных для бактерий группы кишечной палочки, делают препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют, Микробы, красящиеся по Граму, будут темнофиолетового цвета, не красящиеся по Граму (бактерии группы кишечной палочки) — красного цвета.
Из одной и той же проверенной колонии грамотрицательных палочек с каждого сектора среды Эндо проводят высевы петлей на среду Козера и на среду с глюкозой. Пробирки с посевами помещают в термостат и выдерживают 18—24 ч при температуре 37±1 °С (посев на среде Козера) или при 43±1°С (посев на среде с глюкозой) .