Как определить бактерии группы кишечной палочки по стандарту СЭВ?
Оним из санитарно-показательных микроорганизмов, которые могут привести в различного рода токсикозам и кишечным отравлениям, являются бактерии группы кишечной палочки (БГКП). Наличие этих бактерий в молоке говорит о нарушении требуемых санитарно-гигиенических условий производства молока . Они не выдерживают нагрева молока до 60 °C в течение 30 минут. С помощью пастеризации в молоке можно уничтожить лишь вегетативные формы микрофлоры, так как наличие спор повышает тепловую устойчивость микроорганизмов на 10-15, а иногда и на 50 °C. Нагревание молочного сырья до температур пастеризации приводит к инактивации ферментов, тепловая устойчивость которых также индивидуальна, как и тепловая устойчивость микроорганизмов. Температурные режимы пастеризации, принятые в молочной промышленности, полностью инактивируют щелочную фосфатазу. Известно, что после нагревания молока до 65 °C в течение 30 минут фосфатаза в нём не обнаруживается. Тепловая обработка фосфатазы используется в молочной промышленности для оперделения эффективности пастеризации молока при производстве питьевого пастеризованного молока . При производстве кисломолочных напитков или масла эффективность пастеризации определяется пробой на ксантиноксидазу, которая инактивируется при температурах около 80 °C. Протеазы инактивируются при температурах выше 75 °C, нативные липазы — при температуре 80 °C, а бактериальные липазы — при температуре 90 °C. Сущность теплового разрушения микроорганизмов и ферментов состоит в тепловой денатурации белковых компонентов клеток, при которой происходит развертывание их полипептидных цепей с потерей биологических свойств. Теоретические основы пастеризации описываются уравнением Дальберга — Кука применительно к туберкулезной палочке : lnz=α — βt, где z - время воздействия температуры, (c); α,β — коэффициенты, равные 36,84 и 0,48 соответственно; t — температура пастеризации, (°C). Уравнение показывает взаимозависимость температуры и времени для разрушения микроорганизмов и ферментов. На производстве фактическое время выдержки Q при тепловой обработке молочного сырья не должно быть меньше теоретических значений z. При Q=z процесс пастеризации считается проведенным правильно; при Qz — процесс пастеризации излишне длителен. Средний эффект пастеризации равен отношению Q/z. По предложению Кука эта величина была названа критерием Пастера и стала обозначаться символом Pa. Для любого бесконечно малого отрезка времени dQ элементарный эффект пастеризации равен dQ/z, а суммарный эффект за время z обозначается Pa=logdQ / z. Для завершения процесса пастеризации и обеспечения безопасности молочных продуктов критерий Пастера должен быть равен единице или больше её. На основании теоретических выводов для производства молочных продуктов были разработаны три вида режимов пастеризации молочного сырья, обеспечивающие уничтожение туберкулезной палочки , бактерий группы кишечной палочки и других патогенных микроорганизмов и инактивацию ферментов:
◦Длительная пастеризация t=65 °C, z=30 минут
◦Кратковременная пастеризация t=71-74 °C, z=40 с
◦Мгновенная пастеризация t=85 °C, z=8-10 с
◦Ультрапастеризация (Ультрапастеризация молока ) t=125 °C, z=0,5 с
Эффективность пастеризации молочного сырья при производстве различных молочных продуктов зависит от температуры и времени проведения процесса. Большое значение имеет первоначальное бактериальное обсеменение и механическая загрязненность сырого молока . Эффективность пастеризации выражают отношением количества бактерий , уничтоженных пастеризацией, к количеству бактерий , содержавшихся в исходном молоке . Эффективность пастеризации должна достигать 99,5-99,98 %. Для обеспечения такого значения сьрье должно содержать не более 3·106 KOE в 1 см³ общего количества бактерий (мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов КМАФАнМ), причем термостойких бактерий должно быть не более 3·104 в 1 см³, а бактерии группы кишечной палочки не должны обнаруживаться в 0,001 см³ сырья. Эффективность пастеризации по трем показателям после секции охлаждения пастеризационной установки контролируют на производстве не реже 1 раза в декаду. БГКП не должны обнаруживаться в 10 см³ молока , проба на фосфатазу должна быть отрицательной, а общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов не должно быть выше 104 в 1 см³.
Метод с использованием плотной среды. Приготовление разведений производится в соответствии со стандартным методом.
Для определения используют агар с кристаллическими фиолетовым, нейтральным красным, желчью и агар с бриллиантовым зслены.м, фенолротом и лактозой. При посеве на поверхность среды каждое из разведений высевают по 0,1—0,2 мл соответствующего разведения параллельно на две чашки Петри с предварительно хорошо высушенной лактозной агаризоваиной средой. Не позднее чем через 10 мин после нанесения ннокулята на среду его растирают отдельно на каждой чашке согнутой стеклянной палочкой. При посеве в агарнзованную среду по 1 мл исследуемого продукта или разведения засевают параллельно в две чашки Петри. Не позднее чем через 15 мин заливают 15 мл разогретой и охлажденной до 45±1 °С одной из вышеуказанных сред. Посевы хорошо перемешивают, покачивая чашку Петри, и оставляют для застывания в горизонтальном положении.
Для продуктов, обильно обсемененных посторонней микрофлорой или содержащих сублетально поврежденные микроорганизмы, преимущественно используют агар с бриллиантовым зеленым, фенолротом и лактозой.
Посевы инкубируют при температуре 30±0,5°С в течение 48±3 ч. Предварительно посевы просматривают через 24±3 ч и отмечают колонии, типичные для бактерий группы кишечной палочки. Окончательный подсчет количества типичных колоний проводят через 48±3 ч. I Результаты оценивают по каждой пробе отдельно. Для подсчета отбирают чашки с посевами из тех разведений, где выросло F от 15 до 150 типичных колоний бактерий группы кишечной палочки.
Щелочеобразующая сопутствующая микрофлора не оказывает I значительного влияния на морфологию колоний бактерий группы I кишечной палочки при посеве на агар с кристаллическим фиолето% вым, нейтральны.м красным и желчью.
Р При массивно.м росте щелочеобразующей сопутствующей микрофлоры агар с бриллиантовым зеленым, фенолротом и лактозой становится красным и желтая прозрачная зона вокруг колоний сужается или исчезает, однако это наступает, как правило, только после инкубирования в течение 48 ч. Колонии бактерий группы кишечной палочки отличаются от колоний сопутствующей микрофлоры по их желтой окраске и в большинстве случаев по желтому пятну под колонией.
Определение с использованием жидкой сред ы. Приготовление разведений производится в соответствии со стандартным методом.