Как взять редуктазную пробу?
Данные пробы основаны на способности микроорганизмов выделять в среду фермент анаэробную дегидразу, обладаюихую восстановительными свойствами. Редуктазные пробы применяют для оценки бактериологического качества сырого молока. При определении бактериальной обсемененности молока данным методом устанавливают зависимость между временем, необходимым для восстановления индикаторов, и количеством бактерий, причем эта зависимость является обратно пропорциональной. Существуют определенные факторы, влияющие на точность метода: выдержка пробы при 37С благоприятно влияет на обмен веществ не всех групп бактерий, содержащихся в молоке; различные бактерии не в одинаковой степени снижают окислительновосстановительный потенциал. S. lactis и Е. СОІІ быстрее снижают окислительновосстановительный потенциал, чем другие бактерии, находящиеся в молоке. Психротрофные и термостойкие бактерии пробой на редуктазу не учитываются. Следовательно, на совпадаемость результатов, полученных с помошью редуктазной пробы и чашечным методом, влияет качественный состав микрофлоры. Результат редуктазнон пробы показывает не столько количество микроорганизмов, сколько их биохимическую активность. Молоко, находящееся в вымени, обладает сравнительно низким окислительновосстановительным потенциалом. Во время доения, охлаждения, сливания молоко насыщается кислородом и окислительно восстановительный потенциал его повышается примерно до +0,3 В.
При такой величине потенциала краситель остается в окисленной форме. При проведении пробы бактерии развиваются, потенциал снижается и индикатор восстанавливается. Метилсновый голубой восстанавливается, обесцвечиваясь при потенциале от 0,06 до 0,01 В. Применяют 5,5 и 3часовые пробы с метиленовым голубым.
Восстановление" резазурина идет в две стадии и заканчивается при более высоком окислительновосстановительном потенциале (от 0,15 до 0,6 В), Что позволяет проводить пробу за более короткий промежуток времени (в течение 1 ч).
Результат редуктазной пробы зависит от времени года, температуры и длительности хранения молока до начала анализа, концентрации индикаторов, применяемых при проведении пробы, наличия ннгибирующих веществ в молоке и пр. Все эти факторы могут привести к снижению корреляции между результатами, получаемыми при проведении редуктазной пробы и при посеве чашечным методом.
При этой пробе происходит изменение окраски.Изменение окраски фиксируют через 20 мин, 2 ч и 5 ч 30 мин после начала анализа. Пробирки с красителем, необесцвеченным через 20 мин и 2 ч, переворачивают 2—3 раза и снова ставят на термостатирование. Окончанием анализа считается момент обесцвечивания окраски молока, при этом остающийся небольшой кольцеобразный окрашенный слой в верху (примерно I см) или небольшая окрашенная часть в низу пробирки в расчет не принимаются. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают.
Редуктазная проба с метиленовым голубым (ускоренный метод). Для исследования наливают в пробирку (150X15 мм) 10 мл молока и нагревают его на водяной бане до 38—40°С, а затем наливают в эту же пробирку 1 мл рабочего раствора метиленового голубого, приготовленного так же, как и в обычной пробе, но разведенного в 10 раз (к 1 мл рабочего раствора прибавляют 9 мл дистиллированной воды). Пробирки закрывают резиновыми пробками, тщательно перемешивают и ставят на водяную баню или в термостат при температуре 37± 1°С. Уровень воды в бане должен быть выше уровня в пробирке. Наблюдение за изменением окраски ведут через 10 мин.