Человечество использует ферменты для приготовления продуктов питания с незапамятных времен. Эмпирическим путем люди выяснили, что существуют природные субстраты, которые при внесении их в тот или иной вид сырья вызывают в нем желательные изменения.
Такими субстратами были соки растений и ткани животных, содержащие ферменты, а также виноградный сок, молоко, тесто, самопроизвольно сбродившие в результате попадания в них микроорганизмов. Например, для получения сыра использовали соки растений, содержащие фермент фицин, или ткани желудка птиц и животных, содержащие фермент ренин. Для тендеризации мяса (размягчения мышечной ткани) использовали сок папайи, содержащий фермент папайи.
Изучать ферменты начали в XVIII в.. когда были открыты пищеварительные ферменты, выделены ферменты из биологических объектов: пероксидаза из хрена, и α-амилаза из зерна и др. В ХIX в. получены первые чистые формы ферментов и предложен термин «энзим» (от греч, enzymos - связанный с брожением теста). Возникновение энзимологии как самостоятельной научной дисциплины стало возможным с развитием химии, биологии и медицины.
При изучении механизма действия ферментов было высказано предположение, что ферменты образуют комплексы с субстратами. Для объяснения пространственного взаимодействия между ферментом и субстратом Э. Фишер предложил модель «ключ к замку»
Наибольший вклад в развитие энзимологии был сделан в XX в. Были разработаны теория фермент-субстратного комплекса и первая математическая модель для описания ферментативной кинетики.
Однако вопрос о том. как ферменты ускоряют химические реакции, оставался не выясненным до возникновения теории переходного состояния. В 1948 г. Л. Полинг предположил, что каталитическое действие ферментов достигается стабилизацией переходного состояния химических реакций путем взаимодействия с активным центром фермента, что было в дальнейшем подтверждено экспериментально. В 50-60 гг. XX в. был пересмотрен вопрос субстратной специфичности ферментов. Согласно гипотезе «индуцированного соответствия» (модель Кошланда) ферментная активность может регулироваться небольшими молекулами, отличными от молекул субстрата или продуктов реакции. Было показано существование аллостеричных ферментов, разработаны методы регуляции активности ферментов.
Было установлено, что катализ тесно связан с молекулярными взаимодействием между молекулами субстрата и компонентами молекул фермента, а природа и последовательность этих взаимодействий определяются механизмом реакции.
Начало изучения структуры ферментов было положено работой Д. Самнера, который впервые установил белковую природу ферментов. За 20 лет, прошедших после его открытии, было описано более 130 кристаллических ферментов.
В середине XX в. методы рентгеновской кристаллографии и ядерно-магнитного резонанса стали использовать для изучения каталитических свойств ферментов и особенностей фермент-субстратных взаимодействий.
В конце столетия появилась возможность открывать и создавать новые ферменты, ранее не существовавшие в природе, получать микроорганизмы-продуценты ферментов с необходимыми для человека свойствами, идентифицировать ранее неизвестные ферменты, изучить их и модифицировать: изменять аминокислотную последовательность первичной структуры ферментов, а также модифицировать химические группы ферментов, участвующие в образовании фермент-субстратного комплекса.
Достижения современной энзимологии значительно расширили возможности применения ферментов в первую очередь в медицине и пищевой промышленности, где их используют практически во всех отраслях (табл. 1). Это обусловлено их преимуществами по сравнению с химическими катализаторами: избирательностью и стерео-специфичностью действия, возможностью достижения высоких скоростей превращения субстратов при относительно мягких условиях технологии, безвредностью для окружающей среды и человека.
Ферменты не являются чужеродными для организма человека веществами. В пищевых технологиях используют в основном ферменты, присутствующие в пищевом сырье, которые поступают в организм человека при потреблении свежих фруктов и овощей, орехов, молока, сброженных и консервированных продуктов. В пищевых продуктах ферментов содержится мало - миллиграммы на килограмм продукта. При кулинарной и технологической обработке пищевых продуктов ферменты, как правило, инактивируются.
Продолжается поиск новых возможностей использования ферментов в пищевой промышленности. Основными направлениями исследования являются:
-
модификация свойств индивидуальных ферментов с целью повышения их активности и удешевления целевых продуктов;
-
скрининг новых микроорганизмов-продуцентов ферментов;
-
получение новых рекомбинантных ферментов с заданными свойствами;
-
применение ферментативных реакций для получения ценных пищевых ингредиентов и биологически активных веществ;
-
разработка пищевых нанотехнологий с использованием ферментов.
Современные методы модификации ферментов позволяют увеличивать стойкость ферментов к действию различных химических реагентов и ингибиторов, рН, температурному воздействию; изменять рН оптимума ферментов, их субстратную специфичность и связывающие свойства; регулировать предпочтения определенных металлов-кофакторов и каталитические свойства ферментов.
Химическая модификация - наиболее известный вид модификации ферментов [1.2]. Ее методы должны отвечать следующим требованиям:
-
используемые химические реагенты должны быть безвредными (особенно в случаях дальнейшего использования ферментов в пищевых технологиях);
-
условия модификации не должны быть жесткими, приводящими к ухудшению свойств ферментов; модифицированные ферменты должны отделяться от реакционной среды относительно простыми и недорогими способами;
-
применение модифицированных ферментов должно быть экономически выгодным.
|
Отрасль
|
Этапы технологически» процессов и технологические цели применения ферментов
|
|
Технология переработки зерна |
Повышение выхода муки и круп, улучшение качества клейковины, производство модифицированной муки зернобобовых |
|
Хлебопечение |
Сокращение расхода муки, улучшение теста, замедление черстеения изделий, улучшение цвета корочки, производство охлажденного и замороженного теста |
|
Пивоварение |
Использование неосоложенного сырья, разжижение, усиление ферментируемое™, улучшение фильтрации, контроль содержания ззота, получение низкокалорийного пива, стабилизация пива |
|
Технология молочных продуктов |
Коагуляция молока, замена сычужного фермента в производстве сыра, модификация молочного белка, создание сырного аромата, получение ферментативно модифицированных сыров, удаление перекиси водорода, получение молочного сахара |
|
Производство вина, фруктовых соков, газированных напитков, консервов |
Осветление, мацерация сырья, удаление крахмала из сока, увеличение выхода, получение сладких ликеров, стабилизация вин и соков, производство соков с мякотью и пюре |
|
Переработка крахмала |
Увеличение выхода, модификация крахмала, разжижение, осахаривание, получение глюкозо-фруктовых и зерновых сиропов |
|
Спиртовая промышленность |
Конверсия сырья, разжижение крахмала, осахаривание, улучшение роста дрожжей, увеличение выхода спирта |
|
Производство кофе |
Сепарация зерен, контроль вязкости зкетрактов, улучшение вкуса и аромата |
|
Производство белков |
Гидролиз белков и полисахаридов, снижение вязкости, производство модифицированных пептидов и белков |
|
Производство сахара |
Удаление крахмала, белков и полисахаридов |
|
Производство ароматизаторов |
Синтез тонких ароматов, получение натуральных ароматических эфиров и т. д. |
|
Производство масел и жиров |
Увеличение выхода, модификация жиров, экстракция масла, получение биологически активных веществ (лецитина, токоферолов, каротинов и др.) |
|
Технология мясопродуктов |
Увеличение выхода, тендеризация мыса, получение мясных экстрактов, текстуризация белков, продление сроков хранения |
|
Производство растительных экстрактов |
Увеличение экстрактивности, сокращение длительности экстракции, улучшение фильтрации, повышение выхода пигментов, производство чая и чайных экстрактов, сокращение времени экстракции, усиление аромата и цвета |
|
Производство пектина |
Упрощение технологии, увеличение выхода, регулирование степени этерификации |
Примером химической модификации служит модификация ферментов в условиях неполярной (не водной) среды. Происходящее при этом снижение активности воды в реакционной системе существенно изменяет свойства ферментов: реакция сдвигается в сторону синтеза; образуются оптически активные продукты; повышается термостабильность фермента и стабильность при хранении; фермент приобретает способность катализировать новые реакции, не протекающие в водной среде (синтез пептидов, алифатических амидов и др.); ферменты проявляют активность в органических растворителях при температуре выше 100 °С.
Данный способ химической модификации использован при модификации таких ферментов, как липазы [3-5], химотрипсин [6], трипсин [7], субтилизин [8], термолизин [9], полифенолоксидазы [10], глюкоамилазы [11], папаин [12], химозин [13].
С помощью физико-химических методов модификации изменяют силы электростатического взаимодействия, водородные связи и гидрофобные взаимодействия в молекулах белков. Например, широко используемый для изомеризации глюкозы в фруктозу фермент ксилозоизомераза модифицируется в направлении увеличения его термостабильности, снижения значения рН оптимума, изменения предпочтения активирующего катиона металла, изменения субстратной специфичности от ксилозы к глюкозе [14, 15].
К активно развивающимся областям энзимологии относится разработка биологических методов модификации ферментов. Особенно многообещающим является направление, получившее название «белковая инженерия». Методы белковой инженерии, основанные на знании зависимости между аминокислотной последовательностью, трехмерной структурой и каталитической активностью ферментов, позволяют успешно модифицировать ферменты для улучшения их технологических свойств [16, 17].
Широко используется способ замены определенных аминокислот в структурах .молекул ферментов. Показано, что замена в молекуле фосфолипазы А2 Asn89 на Asp и Glu92 на Lys вблизи N-терминального конца спирали 5 увеличивает ккал/моль [18], а замена Asp56 на Ser, Ser60 на Gly и Asn67 на Туr значительно увеличивает активность и средство фосфолипазы А2 к фосфолипидным мицеллам [19, 20].
Путем замены аминокислот в структурах молекул ферментов изменяют также их субстратную специфичность [21-23]
Изменение соотношения активности к растворимому и нерастворимому субстратам у целлобиогидролаз достигается путем замены внешних остатков ароматических аминокислот, которые захватывают конец молекулы полисахарида и направляют ее внутрь активного центра.
Увеличение стабильности ферментов к температуре и экстремальным значениям рН достигается путем таких замен среди сближенных в его третичной структуре аминокислотных остатков, которые приводят к образованию дополнительных нековалентных гидрофобных связей, солевых мостиков или ковалентных S-S-связей, повышающих общую стабильность глобулы молекулы фермента.
Во многих случаях замены осуществляются на основе сопоставления совершенствуемых структyp с соответствующими структурами аналогов из экстремофильных родственных организмов (термо-, ацидо- и алкалофильных).
|
Рекомбинатный фермент
|
Организм - продуцент
|
Область применения
|
|
α-ацетолактатдекарбоксилаза |
Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens |
Производство налитков |
|
Аминогелтидаэа |
Trichoderma reese Trichoderma lonqibrachiatum |
Производство молочных продуктов |
|
α-Амилаза |
Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens |
Производство напитков, хлебопечение |
|
Арабинофуранозидаза |
Aspergillu niger |
Производство напитков |
|
Каталаза |
Aspergillu niger |
Производство продуктов, содержащих куриные яйца |
|
Химозин |
Aspergillu niger |
Производство сыров |
|
Циклодекстрингликозил трансфераза |
Bacillus licheniformis |
Переработка крахмала |
|
α-Глюканаза |
Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens |
Производство напитков |
|
Глюкоамилаза |
Aspergillu niger |
Производство напитков, хлебопечение |
|
Глюкозоизомераза |
Streptomyces lividans |
Переработка крахмала |
|
Глюкозооксидаза |
Aspergillu niger |
Хлебопечение |
|
Глюкозооксидаза |
Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens |
Хлебопечение, переработка крахмала |
|
Липаза, триацилглицерол |
Aspergillus oryzae |
Производство жиров |
|
Мальтогенная амилаза |
Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens |
Хлебопечение, переработка крахмала |
|
Пектинлиаза |
Aspergillu niger |
Производство напитков |
|
Пектинэстераза |
Trichoderma reesei Trichoderma longibrachiatum |
Производство напитков |
|
Фосфолипаза А |
Trichoderma reesei Triclioderma longibrachiatum |
Хлебопечение, переработка жиров |
|
Фосфолипаза В |
Trichoderma reesei Trichoderma longibrachiatum |
Хлебопечение, переработка крахмала |
|
Полигалактозидаза |
Trichoderma reesei Trichoderma longibrachiatum |
Производство напитков |
|
Протеаза |
Aspergillus oryzae |
Производство сыров |
|
Пуллуланаза |
Bacillus licheniformis |
Переработка крахмала |
|
Ксиланаза |
Aspergillu niger |
Производство напитков, хлебопечение |
Иногда повышение стабильности ферментов достигается введением в его структуру специального термостабилизующего модуля, обнаруженного у некоторых бактерий.
Повышение стабильности ферментов к протеолизу осуществляется либо путем удаления сайтов узнавания протеаз из структуры доменов, либо путем увеличения степени гликозилирования через введение в них аминокислот; служащих сайтами О- или N-гликозилирования.
Модификация ферментов осуществляется также с помощью изменения их модульной структуры путем включения или удаления субстратсвязывающего домена. Например, в результате введения в молекулы гликозилтрансфераз целлюлозосвязывающего домена они приобретают способность «сшивать» оборванные концы молекул в аморфных участках на поверхности целлюлозного волокна. Удаление «ненужных» модулей уменьшает массу молекулы, в результате чего повышается эффективность диффузии фермента в субстрат.
Изменение характера действия и субстратной специфичности ферментов достигается, например, делецией петель, перекрывающих активный центр экзогидролаз, что превращает их в родственные эндогидролазы [24].
Один из видов биологической модификации - знзиматическая модификация ферментов. Ферменты используют для модификации протеинов уже более 20 лет. В пищевых технологиях ферменты используются для регулирования функционально-технологических и нутритивных свойств белков [25-27], а также для регулирования функционально-физиологических свойств пищевых белков [28-30].
В 90-х гг XX в. ферменты начали использовать для модификации других ферментов. Сложность осуществления таких реакций обусловлена стерическими факторами, затрудняющими взаимодействие молекул ферментов. Одним из немногочисленных примеров подобной модификации является модификация фосфолипазы А2 тканевой трансглутаминазой [31, 32].
Все шире используются в качестве продуцентов ферментов генетически измененные микроорганизмы. Модификация их генома производится с целью увеличения гиперпродукции продуцируемых этими микроорганизмами ферментов или создания возможности синтеза нехарактерных для данного микроорганизма ферментов.
С целью увеличения гиперпродукции ферментов микроорганизмы подвергают воздействию различных мутагенов (ультрафиолетовых и рентгеновских лучей, химических агентов), вызывающих как гибельную мутацию у большей части микробной популяции, так и мутации, способствующие увеличению продукции ферментов. Для каждого мутагена и микроорганизмы подбирают условия мутагенной обработки, позволяющие увеличить количество выживших мутировавших клеток. Оставшиеся жизнеспособными микробные клетки подвергают скринингу по геномным вариантам, отбирая наиболее активных продуцентов определенных ферментов.
Данный метод, называемым методом классической мутации, впервые был описан в конце 30-х гг. XX в, и активно использовался в 1950-1970 гг. Ему на смену пришли методы модификации генома микроорганизмов, основанные на достижениях генной инженерии. В частности рекомбинантная ДНК (рДНК) технология, позволяющая внедрять в геном микроорганизма гены, ответственные за синтез необходимых ферментов.
В настоящее время налажено промышленное производство микроорганизмов-продуцентов рекомбинантных ферментов. Например, ген, ответственный за выработку фермента химозина, выделенный из эукариотического организма, внедряют в геном микроорганизмов Escherihia coli, Kluyveromyces lactis или Aspergillus awamori, которые становятся продуцентами данного фермента [33]. Бактерии Bacillus subtilus используют как продуценты рекомбинантного фермента ацетолактатдекарбоксилазы [34].
Использование микроорганизмов-продуцентов рекомбинантных ферментов имеет ряд преимуществ. Один и тот же микроорганизм может использоваться как продуцент различных ферментных препаратов, что унифицирует технологию их получения. Выход ферментов значительно увеличивается, например выход глюкоамилазы и эндоксиланазы. продуцируемых рекомбинантными штаммами Aspergillus. превышает выход этих ферментов из традиционных штаммов в 10-30 раз.
Рекомбинантные ферменты отличаются высокой чистотой, что имеет особое значение в пищевых технологиях. Например, использование свободных от протеазной активности амилаз в хлебопечении позволяет улучшить реологические свойства теста, поскольку не происходит разрушения структуры белков клейковины.
Рекомбинантные ферменты широко применяются в пищевых технологиях (табл. 2). Однако, если в непищевых отраслях промышленности рекомбинантные ферменты применяют без ограничений, то пищевые продукты, полученные с использованием рекомбинантных ферментов, должны быть соответственно маркированы для информирования потребителя.
Кроме как из природных источников, ферменты могут быть получены путем искусственного синтеза. Перспективен синтез ферментов, не имеющих полипептидных структур, но содержащих аналоги активных центров существующих ферментов. Созданы ферменты, содержащие синтетические полимеры циклодекстринов и металлопроизводных стероидов, являющиеся матриксом, в котором дополнительные реакционные группы ориентированы как активные центры ферментов [35]
Циклодекстрины широко используются для создания синтетических ферментов, поскольку способны к гидрофобному связыванию в центральной полости активных соединений. На основе β-циклодекстрина получены различные синтетические гидролитические ферменты [35], ферменты с химотрипсиновой [36], трансамилазной и рибонуклеазной активностью [37, 38]. Синтетический химотрипсин был получен путем включения в молекулу β-циклодекстрина каталитических групп - имидозолилбензоиной кислоты или других имидазольных соединений.
Поскольку синтетические ферменты не содержат аминокислотных остатков, они менее подвершены действию таких факторов, как температура, рН, ионная сила, чем природные ферменты, для конформационной стабильности и биологических функций которых данные факторы являются лимитирующими [39-42]. Эти свойства синтетических ферментов расширяют возможности ферментативных технологий, в том числе и в пищевой промышленности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Feeney R. E., Whitaker J. R. Modification of Proteins; Food, Nutritional and Pharmaceutical Aspects // Adv. Chem.Ser. 1982, - Washington D. C: American Chemical Society, 1982.
2. Feeney R. E. Chemical modification of proteins: Comments and perspectives //Int. J. Peptide Protein. Vol. 29.
3. Wong С. H., Chen S. Т., Hennen W. J. et all Enzymes in organic synthesis: Use of subtilisin and highly stable mutant derived from multiple site-specific mutations //J. Am. Chem. Soc. 1990.Vol. 112.
4. Wong С. Н. et all. Enzymatic catalysis in organic synthesis // Meth. Enzymol. 1991. Vol. 202.
5. Klibanov A. M. Enzymatic catalysis in anhydrous organic solvents // TIBS. 1989. Vol 14.
6. Zaks A., Kllbanov A. M. Substrate Specificity of enzymes in organic solvents // J. Am. Chem, Soc. 1986. Vol. 108.
7. Sakural T., Margolin A.L., Russel A.J., Klibanov A.M. Control of enzyme enantioselectivity by the reaction medium //J.Ara. Che. Soc. 1988.
8. Zhong Z., Liu J.L.C., Dinterman L. M. et all Engineering subtilisin for reaction in dimethylformamide // J. Am. Chem. Soc. 1991.Vol. 113.
9. Kitaguchi H., Klibanov A. M. Enzymatic peptide synthesis via segment condensation in the presence of water mimics // J. Am. Chem. Soc. 1989. Vol. 111.
10. Kazandjian R.Z., Klibanov A. M. Regioselcctive oxidation of phenols catallzed by polyphenol oxidase in chloroform // J. Am. Chem. Soc. 1985. Vol. 107.
11. Laroute V., Willemot R. M. Glucose condensation by glucoamilase in organic sovents//Biotechnology Letters. 1989.
12. Stehle P. et all. Papain-catalyzed synthesis of dipeptides: A nivel approach using free amino acids as nucleophiles //Enzyme Microb. Technol. 1990. Vol.12.
13. Aldel Malak С A. Calf chymosin as a catalyst of peptide synthesis // Biochem J. 1992. Vol. 288.
14. Mrabet N. T. et all. Arginine residues as stabilizing elements in proteins // Biochemistry. 1992. Vol. 81.
15. Quax W. J. et all. Enhancing the termostability of glucose isomerase by protein engineering // Bio/Thcchnology. 1991. Vol.9.
16. Goodenough P.W. Food enzymes and the new technology // Enzymes in Food Processing. 2nd ed. Glasgow: Academic and Professional. 1995
17. Law B. A., Manipulation of enzymes for industrial application: Protein and environmental engineering // Industrial Enzymology 2nd ed. Basingstoke: Macmillan Press and New York: Stockton Press, 1996.
18. Pickersgill R. W. et all. Modification of the stability of phospholipase A., by Charge endineering//FEBS Lett. 1991. Vol.281.
19. Thunnissen M.M. et all. Structure of an engineered porcine phospholipase А2 with enhanced activity at 2.1 A resolution. Comparison with the wild-type porcine and Crotalus atrox phospholipase // J. Mol, Biol. 1990. Vol.216.
20. Noel J. P. at. all Phospholipase A2engineering. X-ray structural and functional vidence for the interaction of lysine-56 with substrates // Biochemistry. 1991. Vol.30.
21. Bone R., Silen J. L., Agard D. A. Structural plasticity broadens the specificity of an engineered protease //Naturc.-1989.-Vol.339.-P.191-195.
22. Wilks H. М. et all. Designs for a broad substrate specificity keto acid degidrogenase // Biochemistry. 1990. Vol. 29.
23. Kumagai I., Sudana F. Takeda S., Miura KI. Redesing of the substrate-binding site of hen egg white lysozyme based on the molecular evolution of C-type lysozyme // J. Biol.Chem. 1992. Vol.267.
24. Рабинович М.Л., Мельник М. С., Болобова А. В. Целлюлазы микроорганизмов // Прикл. биохим. и молек. биол. 2002. № 4.
25. Bai H. S., Zhang L. Total hydrolysis of food proteins by the combined use of soluble and immobilized protease // Int. J. Food. Sci. 1999. Vol. 34(1).
26. Капрельянц Л. В., Мiськiн О. М. Регулювання функцiональных властивостей соепродугiв шляхом iндукованого автолiзу // Науковi грацi ОДАХГ. 2002. Вип. 25.
27. Капрельянц Л. В., Мiськiн О. М. Ензиматична модифiкацiя бiлкiв соевого борошна // Науковi грацi ОДАХГ. 2003. Вип. 26.
28. Chobert J. M. et all. Recent advances in enzymic modifications of food proteins for improving their functional properties //Nahrung, 1996. Vol.40 (4).
29. Sule E., Tomoskozi S., Hajos G. Functional properties of enzymatically modified plant proteins // Nahrung. 1998. Vol.42 (3-4).
30. Капрельянц Л. В., Iоргачова К. Г. - ФункцiональнI продукти. Одеса: Друк. 2003.
31. Cordeita-Miele E., Miele L. Mukherjee A. В. A novel transglutaminase-mediated post-translational modification of phospholipase A2dramatically increases its catalytic activity // J. Biol. Chem. 1990- Vol. 265.
32. Cordella-Miele E., Miele L, Beninati S., Mukherjee A. B. Transglutaminase-catalyzed incorporation of polyamines into phospholipase A, // J. Bioehem. 1993. Vol. 113.
33. Dornrnburg H., Lang-Hinrichs C. Genetic engineering in food biotechnology // Chemindustry. 1994. Vol. 13.
34. Alder-Nissen J. Newer uses of microbial enzymes in food processing // TIB-TECH. 1987. Vol. 5.
35. Dugas H. Bioorganic Chemistry. A Chemical Approach to Enzyme Action, - 2nd ed.- New York: Springer-VcHag. 1989.
36. Rao K. R. et all. Artificial enzymes: Synthesis of imidazole substituted at C(2) of β-cyclodextrin as an efficient enzyme model of chymotrypsin // J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1990.
37. Breslow R. et all. Artificial transaminases linking pyridoxamine to binding cavities: Controlling the geometry // J. Am, Chem. Soc. 1990. Vol. 112.
38. Kuroda Y., Hiroshige Т., Ogoshi H. Epoxidation reaction catalyzed by cyclodextrin sandwiched porphyrin in aqueous buffer solution// J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1990.
39. DeGrado W. F, Wasserman Z. R., Lear J. D. Protein design, minimalist approach - Science. 1989. Vol. 243.
40. O'Neil K. Т., Hoess R. H., DeGrado W. F. Desing of DNA-binding peptides based on the leucine zipper motification // Science. 1990. Vol. 249.
41. Robertson D. E. ct all Design and synthesis of multi-haem proteins.- Nature. 1994. Vol. 368.
42. Corey M. J., Hallukova E., Pugh K., Stewart J. M. Studies on chymotrypsin-like catalysis by syntetic peptldes. - Appl. Biochem, Biophys. 1994. Vol. 47.
Источник: tharnika.ru |
